ادغام و اتصال غشاء ویزیکولها با اندامکهای سلولهای یوکاریوتی می آن با نقایص مادرزادی و بس یاری از انواع تومورها مش خص شده

Transkript

1 مدلسازی به روش هومولوژي و شبیهسازی دینامیک مولکولی پروتئین Rab23 انساني به هدف انجام مطالعات Docking با ليگاند كلسترول 1 و 2 شیوا کالنتری 3 محمد تقیزاده 3 معصومه دهقانی 3 آرمین مددکار سبحانی 2 مصطفی رضایی طاویرانی تاریخ دریافت: 1391/06/05 تاریخ تصویب: 1392/03/05 چکيده Rab23 یکی از پروتئینهای خانواده Rab میباش د که مسوول تنظیم ادغام و اتصال غشاء ویزیکولها با اندامکهای سلولهای یوکاریوتی می باشد. این پروتئین یک تنظیمکننده منفی خودکار سلولی برای عالمتدهي hedgehog در مهرهداران است. مسیر عالمتدهي )Signaling) hedgehog در رشد اکثر ارگانها و بافتهای مهرهداران نقش محوری داشته و ارتباط آن با نقایص مادرزادی و بس یاری از انواع تومورها مش خص شده است. بنابراین دخالت Rab23 در این مسیر و ناهنجاریهای بیانی آن در بس یاری از انواع بیماریها دیده می شود. از جمله بیماریهایی که ناشی از جه ش در ژن این پروتئین و یا به طور کلی بیان غیر نرمال آن می باشند عبارتند از: سندرمهای Carpenter و Gorlin کارسینومای تیروئید هپاتوسل کارسینوما تومورزایی و انواع مختلف سرطان. 1. دانشجوی دکترا مرکز تحقیقات پروتئومیکس بالینی دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی 2. دانشیار گروه علوم پایه دانشکده پیراپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی 3. دانشجوی دکترا مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک دانشگاه تهران )نویسنده مسئول( taghizadeh@ibb.ut.ac.ir

2 44 زیستشناسی کاربردی / بهار و تابستان 1392 مواد و روشها: در این مطالعه مدلس ازی این پروتئین با استفاده از نرمافزار Modeller9v7 پس از انتخاب الگوي مناسب با میزان شباهت باال از داده پایگاه PDB به انجام رس ید. بهترین مدل س اخته شده از طریق آنالیزهای نرمافزار Procheck برای ورود به مرحله شبیهسازی انتخاب ش د. شبیهسازی دینامیک مولکولی آن با استفاده از نرمافزار GROMACS به انجام رسید و سپس نواحی اتصال آن با کلسترول با استفاده از نرمافزار Autodock4.2 به دست آمد. یافتهه ا: پایداري نم ودار RMSD و انرژی نش ان ميدهند كه مدل ساختار سهبعدي به دست آمده كامال پايدار بوده لذا به واقعيت نزديك است. مطالعات Docking نشان ميدهد كه اين پروتئين جايگاه اتصالي براي كلسترول دارد. نتیجهگیری: داشتن جایگاه اتصال برای کلسترول بدان معني است كه اين پروتئين عالوه بر انجام عملكرد خود با همكاري ديگر پروتئينها مث ل GLI2 و GLI3 ب ا ورود به داخل غش ا در ناحي هاي كه داراي كلسترول است بخش ديگري از عملكرد خود را در اتصال غشا وزيكول انجام ميدهد. با توجه به اهمیت بیولوژیک Rab23 شبیهسازی آن در محیط in silico میتواند در جهت اهداف درمانی برای طراحی دارو و یا لیگاندهای مهاری مفيد باشد. واژهه ای کلی دی: مولکولی بنیان )هولوژی( شبیهس ازی دینامیک مدلسازی به روش همسان Rab23 مقدمه Rab خان واده از پروتئینه ای یک ی Rab23 میباشد که مس وول تنظیم ادغام و اتصال )docking( غش ا ویزیکوله ا ب ا اندامکهای سلولهای یوکاریوتی از مخمر تا انسان است )2003 al..)evans et ژن این پروتئین در ناحیه پری سانترومری کروموزوم 6 بین مارکرهای میک رو س اتالیت D6S257 و D6S1659 و درون ناحیه بحرانی و مهم RP25 قرار گرفته اس ت )2003 al. )Marcos et و خود پروتئین نیز در غشای پالسمایی و مسیر اندوسیتیک واقع میباشد al Marcos et و Evans et.)al عملکرد پروتئینهای Rab با گردش بین یک فرم غیر فعال س یتوزولی متصل به GDP و ی ک فرم فعال در اتصال به غش ائ متصل ب ه GTP انجام میگی رد. این چرخه عملکردی به ش دت با یک سری پروتئینهای یدک ی 1997( al. Olkkonen et و al. Alory et 2001( تنظیم میشود. پروتئینهای Rab توسط مهارکنندهه ای تفکیکی نوکلئوتی د گوانین

3 45 مدلسازی به روش هومولوژي و شبیهسازی دینامیک مولکولی پروتئین... GDIs: guanine (nucleotide dissociation( inhibitors در وضعی ت غیر فعال متصل به GDP در سیتوزول نگه داشته می شوند. این مهارکنندهها با اتصال به قسمت پرنیله شده C- ترمینال و پوشانیدن این جایگاه تغییر پس ترجمهای هیدروفوبیک عم ل خود را انجام میدهند. به محض اتص ال پروتئین Rab به یک ویزیکول GDI توسط فاکتور تفکیککننده GDI برداشته میشود. فاکتورهای تعویض نوکلئوتی د گوانی ن Guanine( GEFs: )nucleotide exchange factors تعوی ض GTP با GDP را تس هیل ک رده باعث فعال شدن پروتئین Rab و برداشته شدن مقاومت آن برای کنده ش دن از غش ا توس ط GDI میش وند. اتصال یا لنگر اندازی )docking( ویزیکول دهنده با غش اء هدف زمانی اتفاق میافت د که پروتئی ن Rab در وضعیت فعال خود یا فرم متصل به GTP باش د. پروتئین Rab فع ال ب ا هیدرولیز GTP ب ه GDP به وضعیت غیر فعال خ ود بر میگردد که این مرحله توسط خود پروتئین Rab کاتالیز شده و با کمک پروتئینه ای فعالکننده GTPase( (GAPs:GTPase activating proteins سرعت مییابد. زمانی که پروتئین در وضعیت متصل به GDP است GDI پروتئین Rab را از غشائ هدف به س یتوزول یعنی محل شروع مجدد چرخ ه ره ا میکن د 2003( al..)evans et پروتئینهای Rab در وضعیت فعالش ان یک س ری مولکولهای افکتور درگیر در تشکیل ویزیک ول را آم اده ک رده و ویزیکولها را نیز برای غش ای هدفش ان و مراحل ادغام غشایی و همچنین به اس کلت سلولی آماده میکنن د 2006( al..)grrosshans et در حین انج ام اینگونه اعمال این پروتئینها به مانند کلیده ای مولکولی ب رای هماهنگی انتقاالت غش ایی با ظرافت تمام عمل میکنند. Rab23 یک تنظیمکننده منفی خودکار س لولی برای عالمتدهي hedgehog در مهرهداران اس ت Eggenschwiler et al. و Simpson et al. 2009( 2001(. علیرغم مشخص شدن اینکه Rab23 عالمتدهي sonic hedgehog را در طول رشد تنظیم میکند اما پروتئینی که توسط Rab23 در این مس یر انتقال مییابد هنوز ناشناخته است )2006 al..)wang et به نظر میرسد که hedgehog معکوس کننده عالمتدهي Rab23 باش د و جهش ژن این پروتئین موجب نقص شدید در رشد لوله عصبی در موش میگردد Wang et و Eggenschwiler et al. 2001( al و al )Eggenschwiler et و همچنین ناهنجاریهای ی در اندامهای مختلف در بیم اران مبتال به دو س ندرم Carpenter و Gorlin ایجاد میکن د 2006( al. Oostra et و al )Jenkins et ب ه عالوه از آنجایی ک ه ژنه ای hedgehog مث ل shh خ واص انکوژنیک دارن د 1999( al. Rab23 )Ruiz et در کارسینوژنسیس درگیر خواهد بود. بیان غیرعادی Rab23 در س لولهای کبدی همانند کارس ینومای تیروئید مش اهده شده است.)Denning et و al Liu et al. 2007( افزای ش بی ان Rab23 در بیماریهایی از قبیل atrophic gastritis که نوع ابتدایی سرطان معده است نیز مشاهده شده است )2007 al..)kim et عالمتده ي hedgehog ب ه طور خالصه در زیر شرح داده شده است. عالمتدهي hedgehog چیست مس یر عالمتدهي hedgehog در رشد اکثر ارگانها و بافتهای مه رهداران نقش محوری

4 46 زیستشناسی کاربردی / بهار و تابستان 1392 داش ته و ارتباط آن با نقای ص مادرزادی و بس یاری از انواع تومورها مش خص شده اس ت 2003( al. MacMahon et و al et Riobo و al )Wang et به طور خالصه پیش س ازهای لیگاند Hh ک ه از فراوانترین آنها می توان به sonic hedgehog اش اره کرد )shh( به ط ور اتوکاتالیتی ک از یک فرم 45 کیلودالتونی به ی ک پروتئین متصل به لیپید 19 کیلودالتونی پردازش میشوند که توسط س لولها به ماتریکس خارج س لولی ترشح میگردند. تغییراتی که به طور کواالن بر روی Hh های ترشح شده صورت میگیرد عبارتند از : اتصال اس ید پالمیتوئیل ب ه N- ترمینال -C ب ه و کلس ترول )Pepinsky et al. 1998( ترمینال )1996 al..)porter et لیگاند ترشحی به گیرنده خود به نام ptch متصل شده و بنابراین س رکوب پروتئینی به ن ام smo که هفت بار عرض غش ا را طی میکند برداشته میشود. پروتئین smo به نوبه خود س یگنالی اس ت برای آبش ار عالمتدهي hedgehog توس ط اتصال لیگان د sonic hedgehog (shh) desert )Indian hedgehog (Inn و یا )hedgehog (Dhh به گیرنده PTCH )ک ه میتواند PTCH1 و یا PTCH2 باشد( آغاز می گردد. چنین اتصالی باعث برداش ته ش دن مهار فعالیت از SMO ش ده که فاکتورهای رونویس ی هومولوگ انکوژن همراه گلیوما )Gli( را )که ش امل Gli Gli 2 1 و Gli 3 اس ت( ب رای اثرگذاری بر بیان ژنهای هدفش ان فعال می کند et( Ruiz.)al ب ا این ح ال از زمان ایجاد جنین تا بزرگسالی سلولهای منشاء معدی-رودی و پوست توسط عالمتدهي Hh تنظیم میشوند نقشهای دیگر Rab23 افزای ش بیان Rab23 قطع ا میتواند به مهار تمایز کندروژنی ک بیانجامد و همچنین بیان ژنهای ماتریک س از قبی ل کالژن تیپ II و اگرکان )2008 al. )Yang et را کاهش میدهد. ای ن پروتئین همچنین در غنیس ازی مغز و نورونها نیز نقش دارد )1977 al..)geppert et عالوه بر اینها در فرآیند رش د نورونها فرای عالمتدهي sh نیز مؤثر میباشد چرا که بیان آنها در نورونهای بزرگس االن نیز مشاهده شده است )2006 al..)guo et این پروتئین در سلولهای مزانشیال و پودوسیتها در گلومرول نی ز بی ان میش ود 2009( al..)huang et ظاهرا بیان Rab23 میتواند بر تکثیر س لولی تأثیرگذار باش د. اخیرا در چندین گزارش به بیان بیش از اندازه Rab23 در انواع مشخصی از سرطانها اشاره شده است )2007 al. Liu et و al Denning et و al )Kim et حذف پروتئین Rab23 در واقع میتواند رشد سلولهای هپاتوکارسینوما را مهار کند et( Liu )al و این نش اندهنده اثر تسهیلکننده این پروتئین در هپاتوماها میباش د. اگرچه که این پروتئین میتواند مس یر عالمتدهي Wang et al. 2006( را متوقف کرده hedgehog و al )Ruiz et و باعث پیشرفت رشد در سلولهای س رطانی خاص شود al.( Yuan et 2007 و al Zhang et و al )Zhu et اما میتواند بر عکس برای بعضی از سلولهای خاص هم نقش ضد تکثیری داشته باشد. Rab23 و بیماریها HCC در تومورزای ی مهم ی نق ش Rab23 )هپاتوس ل کارس ینوما( و س ایر تومورها داش ته بنابراین میتوان از آن به عنوان یک Ruizi et و al Clatworthy et al. 2001( و al )Van den Brink et

5 47 مدلسازی به روش هومولوژي و شبیهسازی دینامیک مولکولی پروتئین... ه دف بیولوژی ک جدید برای پیش گیری و درم ان HCC یاد کرد. از آنجا که بیان آن در HCC زیاد شده و یا فعالیت آن افزایش مییابد میتوان آن را هم به عنوان یک پیشگوییکننده این بیماری و هم هدفی برای درمان آن دانست FSGS در پیش رفت Rab23.)Liu et al. 2007( )(Focal Segmental Glomerusclerosis نی ز نقش داشته و می توان آن را به عنوان مارکر بیولوژیک FSGS به حس اب آورد et( Huang.)al از آنجای ی که این پروتئین به طور پیوسته در سلولهای مزانشیال بیان میشود در واق ع میتوان انتظار داش ت ک ه انتقال پروتئینهای مختل ف را که نقش فیزیولوژیک دارند و برای س لولهای مزانشیال ضروری هستند عهدهدار است. ب ا این حال با توجه ب ه افزایش بیان Rab23 در سلولهای مزانش یال در بیماران مبتال به FSGS میتوان چنین برداشت کرد که بعضی از پروتئینهایی که توس ط آن در س لولهای مزانشیال انتقال مییابند در رشد یا پیشرفت بیمار FSGS دخالت دارند 2009( al..)huang et عالوه بر بیماریهای ذکر ش ده درگیر بودن این پروتئین به واسطه جهشهای ایجاد شده در ژن آن در بیماری سندرم Carpenter نیز گزارش شده است 2007( al..)jenkins et با توجه به اهمیت این پروتئین در بیماریهای ذکر ش ده و با توجه به اینکه نوع انسانی آن کریس تالوگرافی نشده است به نظر میرسد که مدلس ازی آن ب ه عنوان اولی ن قدم در راس تای اهداف آین ده برای تس ت کردن داروهای احتمالی در جهت مهار آن در بعضی بیماریهای خاص ضروری باشد. مدلسازی این پروتئین کلیدی با اس تفاده از نرم افزار Modeller 9V7 و شبیهس ازی آن در محیط آبی با اس تفاده از نرمافزار GROMACS در این مقاله به انجام رسیده است. روشها همترازي توالي در مرحله اول توالی پروتئینی Rab23 انسان )با کد شناسایی Q9ULC3 در )Uniprot که یک پروتئین مربوط به خانواده Ras است از داده پایگاه Uniprot به فرمت FASTA گرفته ش د. سپس از طریق ابزار BLAST بر علیه پايگاه داده PDB مورد جستجو قرار گرفت تا از این طریق الگوی مناسبی با شباهت قابل قبول و همچنین E-Value پایین به دس ت آمد. بر این اساس ساختار کریستالوگرافی شده زنجیره A از پروتئی نRab23 GTAPase متص ل به GDP موشي )PDB:1z22( انتخاب و به عنوان ساختار الگو برای مدل کردن 3 بعدی Rab23 انسان مورد استفاده قرار گرفت. پیشگوی ی س اختار س وم از طریق مدلسازی به روش هومولوژي ساختار سوم پروتئین هدف با استفاده از نرم افزار )Sali Blundell, 1993( Modeller9V7 با استفاده از مدلس ازی مقایسهای ایجاد شده و ب ا اس تفاده از نرماف زار weblab viewer ) Accelrys( مشاهده و بررسي گردید. )این نکته الزم به ذکر اس ت که با استفاده از نرم افزار Modeller9V7 مدل ساخته شد(. ارزیابی ساختار سوم بهترین مدل از بین مدل ساخته شده توسط Modeller به کمک دو معادله ارزیابی کنن ده ب ه نامه ای Dope score و Molpdf انتخاب ش د. یک مدل انتخابی بر اساس هر

6 48 زیستشناسی کاربردی / بهار و تابستان 1392 ک دام از این دو معادله به عنوان بهترین مدل احتمالی ارائه شد. بهترین مدل به دست آمده با کمترین می زان Dope score برای ش بیه سازی دینامیک MD( )Molecular Dynamic: مورد استفاده قرار گرفت. به منظور ارزيابي کیفیت پارامترهای س اختاری مدل س اخته شده از نرم افزاری به نام Procheck استفاده ش د. نمودارهاي راماچان دران برای الگو و پروتئین هدف به دست آمد که در ادامه مورد بحث قرار خواهد گرفت. شبیهسازی دینامیک مولکولی شبیهس ازی دینامیک مولکولی با اس تفاده از نرماف زار )version )4.07 GROMACS به انجام رسید. برای خنثیسازی سیستم و ایجاد تعادل بار دو یون سدیم به جای مولکولهای آب به سیستم اضافه گردید. زمان شبیهسازی 10 نان و ثانیه در نظر گرفته ش د و گامها را معادل ٢ پيك و ثانيه در نظر گرفتيم و از مدل آب SPC وي ژه Force Field گروموس در اين شبيهسازي ديناميك مولكولي استفاده شد. جايابي ليگاند )Docking( براي انجام Docking از نرمافزار Autodock4.2 استفاده شد و براي اين منظور الگوريتم ژنتيك الماركين به منظور جستجوي كنفورماسيونها انتخاب شد. نتایج و بحث مدلسازی ساختار سه بعدي Rab23 انساني با استفاده از يك الگوي با شباهت باال با پروتئين Rab23 انساني يك مدل با كيفيت از اين پروتيئن ساخته شد. با استفاده از چندين روش ارزيابي كه در ادامه ذكر ش ده است كيفيت باالي مدل تاييد ميشود. الگوی منتخب دارای 237 اسید آمینه میباشد و در سال 2007 با قدرت تفکیک 2/06 آنگستروم کریس تالوگرافی شده است. میزان یکس انی الگو با پروتئین هدف 96% و میزان شباهت آن 98% میباشد. از آنجایی که میزان شباهت الگو با پروتئین هدف بسیار زیاد است و این احتمال را ایجاد میکند که مزیتی در مدلسازی برای آن وجود ندارد اما باید خاطر نشان کرد که با توجه به اهمیت این پروتئین در پروسههای اندام زایی و عالمتدهي و درگیر بودن آن در بسیاری از بیماریها و به خصوص س رطان اولین قدم در انجام مطالعات بعدی جهت طراحی دارو ی ا لیگاندهای مهاری و یا فعالکننده بسته به نوع بیماری قطعا مدلسازی این پروتئین میباشد. الزم به ذکر است که فقط 168 رزیدو از پروتئین الگو با هدف همردیف ش ده و برای بقی ه رزیدوه ای آن در PDB الگوی مناسبی یافت نشد. این بدان معنی است که 69 رزیدو از Rab23 مورد مدلس ازی قرار نگرفته اس ت اما فقدان این قسمت از پروتئین هدف اشکالی در مدل نهایی ساخته شده ایجاد نخواهد کرد چراکه بر طبق اطالعات حاصل از Uniprot ای ن ناحیه از پروتئین در کنار توالی سیگنال پپتید واقع اس ت که در پروتئین بالغ حذف ش ده و جایگاه اتصال محس وب نمی ش ود. چنانكه در شكل يك مي بينيد ساختار داراي مقدار Random Coil )ريبون خاكستري( اندكي اس ت و بخش اعظم س اختار مدل از هليكسهاي آلفا و رش تههاي بتا در قالب يك صفحه بتا تشكيل شده است. نحوه ارزیابی مدل به چهار روش مختلف ميزان صحت و كيفيت مدل مورد بررسي قرار گرفت. اول با استفاده

7 49 مدلسازی به روش هومولوژي و شبیهسازی دینامیک مولکولی پروتئین... شكل ١. ساختار سهبعدي مدل پروتئين Rab23 انساني E E-02 template best-mod-dope best-mod-pdf -2.00E E E E E E-02 شکل ٢. مقایسه بین الگو و بهترین مدل انتخاب شده بر اساس Dope و PDB از توابع ارزيابي نرمافزار Modeller ش امل Dope Score و.MolPdf ه ر كدام از آنها يك امتياز براي هر يك از ١٠٠٠٠ ساختار ساخته شده ارائه دادند. براي هر دو تابع كمترين مقدار بهترين ساختار را نشان ميداد لذا با استفاده از هر تابع يك ساختار انتخاب شد. روش دوم شامل بررس ي نمودار Dope Score براي هر باقيمانده اسيد آمينهاي بود. چنانكه در شكل ٢ ميبينيد نمودار Dope Score براي ساختار كريس تالوگرافي الگو با عن وان Template و هر دو س اختار مدل انتخاب شده به وسيله هر دو تابع ارزيابي ديده ميش ود. هر سه با هم ش باهتهاي زيادي دارند. در اين نمودار بخش هايي از توالي كه امتياز دوپه مساوي يا كمتر از ٠/٠٣ را دارا هس تند جز نقاط قابل قبول به حساب ميآيند و در بخشهاي باالي اين مقدار اگر براي الگو نيز ش ريط به همين صورت باشد باز هم قابل قبول خواهد بود. بر اين اساس كل باقيمانده ها در هر دو ساختار انتخاب شده وضعيت قابل قبولي دارند. اين به آن دليل است كه هر دو ساختار مدل شباهت زي ادي با يكديگر و با س اختار الگوي خود دارند. روش سوم ارزيابي كيفيت مدل استفاده از Procheck است كه در بخش بعدي ذكر شده است. روش چهارم ارزيابي بررسي پايداري ساختار در جعبه شبيهسازي مولكولي بود كه

8 50 زیستشناسی کاربردی / بهار و تابستان 1392 در بخش شبيهسازي ديناميك مولكولي به آن پرداخته شده است. نتایج Procheck برای ارزيابي كيفيت ساختار Rab23 انساني به عنوان مدل ساخته ش ده نياز به بررسي فاكتورهاي بيش تري وجود دارد. ش كل ٣ نمودارهاي راماچاندران براي پروتئين الگو م دل منتخب دوپه و م دل منتخب MolPDF را نشان مي دهد. چنانكه ديده ميشود نقاط قرمز غير مجاز در هر س ه نمودار بس يار اندكاند و اين بدان معني است كه هر دو مدل كه كامال با هم ش بيه هس تند كيفيت بااليي دارن د. ج دول ١ دربرگيرن ده پارامترهاي آماري نمودارهاي داماچاندران است. چنانكه ديده ميشود هر دو مدل در ناحيه غير مجاز كمتر از ١ درصد باقيمانده را نشان ميدهند و البته اين عدد براي مدل دوپه صفر است. و اين نشان ميدهد مدل دوپه اندكي بهتر است. بررسيهاي ديگري به وسيله پروچك انجام شد كه تنها به اين نكته اشاره ميشود كه ديگر بررس يها نيز بر كيفيت باالي ساختارهاي مدل بدست آمده تاكيد ميكنند. شبیهسازی دینامیک مولکولی مدل دوپه براي Rab23 انس اني در مجاورت مولکوله ای آب قرار داده ش د ت ا بتواند به کنفورماس یون پایدار در محیط آبی برسد. مقایس ه هر snapshot از شبیه سازی که هر 0/002 پیکوثانیه س اخته میش ود با frame اولیه در ش کل 8 نش ان داده شده است. این مقایس ه ب ه ص ورت Square( Root Mean Deviation ) RMSD بی ن ه ر دو frame در فرايند شبیهسازی بیان میشود. شیب نمودار RMSD بیانکنن ده پایدار بودن مدل در طول زمان شبیهس ازی )10 نانوثانیه( اس ت. هر چه این ش یب به صفر نزدیکتر باش د مدل شبیهسازی ش ده پایدارتر و هر چه شیب به تدریج افزایش یابد و يا نوسان زيادي داشته باش د مدل ناپایدارتر خواه د بود. در مورد م دل Rab23 هیچ ناپای داری در طول زمان شبيهسازي مشاهده نشد )شکل ٤(. نم ودار دیگ ری که رون د صحي ح فرايند شبیهسازی را نش ان میدهد نمودار انرژی اس ت )ش کل ٥(. برخالف نم ودار RMSD کاهش ش یب نم ودار ان رژي بیانگر کیفیت بهتر شبیهسازی است چراکه انرژی کمتر در شکل ٣. نمودار راماچاندران به ترتيب از راست به چپ براي پروتئين الگو مدل منتخب دوپه )Dope( و مدل منتخب MolPDF قرار داده شده است. چهار ناحيه با رنگهاي مختلف در هر نمودار ديده ميشود. ناحيه كامال سفيد ناحيه غيرمجاز است و هر نقطه قرمز رنگ در هر نمودار نشاندهنده يك اسيد آمينه با زاوه في و ساي غيرمجاز را نشان ميدهد.

9 51 مدلسازی به روش هومولوژي و شبیهسازی دینامیک مولکولی پروتئین... جدول 1. مقایسه پارامترهای آماري نمودار راماچاندران برای الگو Dope score و Molpdf Disallowed region% Generously allowed region% Additional allowed region% Most favored regions Name 0% 0% 9.2% 90.8% Template 0% 0.7% 5.2% 94.1% Dope model 0.7% 0% 6.5% 92.8% PDF model شکل ٤. نمودار RMSD برای مدلهای ساخته شده در GROMACS شکل 5. نمودار انرژی پروتئین شبیهسازی شده در طول 10 نانو ثانیه حالت پایداری بیشتر حاصل میشود. تغییرات انرژی در این نمودار پس ازكاهش در ابتداي فرايند در باقي مس ير با نوسان ثابتي همراه بوده و بنابراین مدل س اخته ش ده در طول زمان شبیهسازی پایدار میباشد. بازه نوسان به مقدار ٠/٠٠٢ تا ٠/٠٠٣ كيلوژول بر مول قابل قبول اس ت. اين در حالي است كه در نمودار انرژي اين شبيهسازي ديناميك مولكولي بازه نوسان بسيار كمتر از اين مقدار است. وضعیت تغييرات ساختار دوم در طول زمان شبیهسازی در شکل ٦ نمایش داده شده است. اس تمرار یک رنگ از سمت چپ به راست به

10 52 زیستشناسی کاربردی / بهار و تابستان 1392 شکل ٦. نمودار برآورد پایداری ساختار دوم پروتئین هدف در طول زمان شبیهسازی معنی پایداری ساختار دوم در آن ناحيه است و ناپایداری ساختار دوم معادل تغییرات رنگ در هر خط میباش د. بنابراین تفاسیر به نظر میرس د که در مورد پروتئین هدف ساختار دوم در طول زمان پایدار باش د. با بررس ي بخشهاي داراي نوسان ساختار دوم ميتوان به نتايج جالبي رسيد. اما در اين بررسيها ما از اين نمودار فقط براي مشخص كردن پايداري ساختار اس تفاده كرديم و پس از اطمينان از كيفيت باالي س اختار مول به دست آمده از آن براي مطالعه مكانيس م عملكرد پروتئين Rab23 انساني استفاده كرديم. البته از چنين ساختاري ميتوان در بررسيها و آزمايشات ديگر استفاده كرد. پیشگویی ساختار سوم بعضی از پروتئینها که به سختی کریستال میشوند برای اهداف درمانی مزایای زیادی دارد. به عنوان مثال اگر پروتئینی نقش حیاتی در مسیرهای شناخته شده داشته باش د و یا نقش آن در مکانیسم یک بیماری معلوم باش د پیشگویی ساختار آن از طری ق ابزار in silico به منزله میانبری برای طراح ی داروی آن بیماری خواهد بود. به عبارت دیگر طراحی یک داروی مؤثر برای فعالسازی و یا مهار یک پروتئین خاص در یک بیماری خاص با شبیهسازی ساختار سوم آن پروتئین مقرون به صرفه بوده و روند درمان را تسریع می کند. از آنجایی که افزایش بیان پروتئین Rab23 به انواعی به س رطان منجر میشود پیشگویی س اختار آن می تواند اولین قدم برای گرفتن اطالع ات در م ورد خواص س اختاری این پروتئین به منظور مهار و یا توقف فعالیت آن در جلوگیری از سرطان باشد. آناليز نتايج جايابي ليگاند )Docking( ب راي Rab23 ب ه عن وان گيرن ده و كلسترول به عنوان ليگاند با اس تفاده از نرم افزار اتوداك )AutoDock( يك جايگاه اتصال با تمايل زياد براي كلسترول به دس ت آم د. بهترين مكان اتص ال داراي تغييرات ان رژي آزاد اتصال ٨/٢- كيلوكالري بر مول بود. ش كل ٧ نمايشدهن ده بهترين كنفورماس يون انتخاب ي اتص ال Rab23 به كلس ترول توسط اتوداك را نش ان ميدهد.

11 53... پروتئین مولکولی دینامیک شبیهسازی و هومولوژي روش به مدلسازی نش اندهنده تواند مي اتصالي جايگاه چنين اتصال در Rab23 عملكرد احتمالي مكانيس م اين باشد. اندامكها غش ا با وزيكولها غشا هنگام در Rab23 پروتئين ميدهد پيشنهاد نتايج غشا داخل در نيمه تا غشا سطح بر گرفتن قرار داراي جايگاههاي جذب همچنين و ميرود فرو خود وظايف ترتيب اين به و ميشود كلسترول كه ساختار از بخشي ميرس اند. انجام به را ليگاند اطراف در و ميش ود ديده ٧ شكل در كه است بخشي واقع در دارد قرار كلس ترول بررسيهاي از آمده دست به نتايج پيشنهاد به گيري جهت ميرود. فرو غش ا داخل در داك اين نيز خ ود اتصال جاي گاه در كلس ترول كنفورماسيون دو ميكند. تاييد را مكانيس م جهتگيري دو ميشوند ديده شكل در كه برتر به Rab23 كلسترولي پاكت در را يكديگر مقابل باال به رو قطبي سر با يكي است. آورده وجود ميشود. ديده پايين به رو قطبي سر با ديگري و غشا دوم اليه از ميتواند باال به رو قطبي سر و دورتر اليه از يعن ي پيوندد به پروتئين ب ه از واقع در پايين به رو قطبي سر با كلسترول ميرسد. پروتئين اين به Rab23 به نزديك اليه باقیمانده پروتئین با کلسترول برهمکنش در پیوند کلسترول هیدروکسیل گروه با ASP-117 باقیمانده سه همچنین میکند برقرار هیدروژنی نزدیکی تم اس ALA-12 و TYR-31 PHE27 برهمگنش ایج اد در که دارند کلس ترول با مهمی نقش میتواند گریز آب و واندروال س برهمکنش نقش گفت میتوان لذا باشد داشته بیش تری حدودی تا گریز آب و واندروال س این )بر است الکتروستاتیک برهمکنشهای از لیگاند اطراف باقیماندههای بیشتر که اس اس با پروتئين اين البته هس تند(. گریز آب نوع از GLI2 مانند ديگري پروتئينهاي از گرفتن كمك در ميرساند. انجام به را جود وظايف GLI3 و پروتئينها ديگر با Rab23 برهمكنش ٨ شكل بخشي كه شكل اين نمايش با ميش ود. ديده PPI (Protein-Protein interaction( ش بكه از شود تاكيد اس ت شده سعي اس ت انساني غش ا اتصال در Rab23 پروتئين عملكرد كه در آنچه ب ر عالوه اندامكه ا و وزيكوله ا از گرفتن كمك با شد پيشنهاد بررس يها اين هب GLI3 و GLI2 بزرگ بس يار پروتئينهاي بخشي تنها شد پيشنهاد آنچه لذا ميرسد. انجام ساختار است. آمده دست به داك بررسيهاي توسط كه كلسترول با Rab23 پروتيئن اتصال كنفورماسيون بهترين ٧. شكل قطبي سر رنگ آبي زمينه پس با راست سمت در است. شده داده نمايش )Ball and Stick( عصا و توپ مدل با كلسترول ديد. ميتوان پايين سمت به را كلسترول قطبي سر روشن پسزمينه با چپ سمت در و ميدهد نشان باال سمت به را كلسترول

12 1392 تابستان و بهار / کاربردی زیستشناسی 54 انساني ديگر پروتئينهاي با Rab23 برهمكنش ٨. شكل و Cytoscape افزار نرم از استفاده با شكل ميشود. ديده كه Pathway Commons نام به دادهاي پايگاه از استفاده با است. شده ساخته است داده پايگاه چندين از مجموعهاي تاكيد بايد البته و باشد ميتواند مكانيسم كل از است پيشنهادي مكانيسم يك تنها اين كه كنيم بيشتر هاي بررس ي به نياز آن اثبات براي و صورت در دارد. وجود محاس باتی و تجربی وسيله به پيش نهادي مكانيسم بيش تر تاييد بخش ميتوان ديگر بررسيهاي و آزمايشات به وزيكولها اتصال مكانيسم از توجهي قابل كه كرد مشخص را سلول در مختلف هاي غشا تاثیر بر دال شواهدی بود. خواهد توجه قابل متابولیس م و ذخیره بر RAB های پروتئی ن در اما )Wang et al. )2012 دارد وجود لیپیدها تجربی اطالعات کلسترول با برهمکنش مورد شده ارائه نتایج به توجه با لذا است نشده ارائه با کلسترول برهمکنش بررس ی مقاله این در پیش نهادات قبول یا رد به تواند م ی RAB23 شود. منجر کار این احتمالی

13 55 مدلسازی به روش هومولوژي و شبیهسازی دینامیک مولکولی پروتئین... Refrences Alory, C. Balch, W.E. (2001). Traffic. 2: Clatworthy, J. Subramanian, V. (2001). Mechanism of Development. 101(1-2): 3-9. Denning, K. Smyth, P.C. Cahill, S.F. Finn, S.P. Conlon, E. Li, J. Flavin, R.J. Aherne, S.T. Guenther, S.M. Ferlinz, A. O Leary, J.J. Sheils, O.M. (2007). Modern Pathology. 20(10): Eggenschwiler, J.T. Bulgakov, O.V. Qin, J. Li, T. Anderson, K.V. (2006). Developmental Biology. 290(1):1 12. Eggenschwiler, J.T. Espinoza, E. Anderson, K.V. (2001). Nature. 412(6843): Evans, T.M. Ferguson, C. Wainwright, B.J. Parton, R.G. Wicking, C. (2003). Traffic. 4(12): Geppert, M. Goda, Y. Stevens, C.F. Sudhof, T.C. (1977). Nature. 387: Grosshans, L. Grosshans, D. O. Novick, P. (2006). Proceedings of the National Academy of. Science. 103(32): Guo, A. Wang, T. Ng, E.L. Aulia, S. Chong, K.H. Teng, F.Y. Wang, Y. Tang, B.L. (2006). Journal of Neuroscience Research. 83(6): Huang, T. Shui, H. Ka, S.M. Tang, B.L. Chao, T.K. Chen, J.S. Lin, Y.M. Chen, A. (2009). Nephrology Dialysis Transplantation. 24(3): Jenkins, D. Seelow, D. Jehee, F.S. Perlyn, C.A. Alonso, L.G. Bueno, D.F. Donnai, D. Josifiova, D. Mathijssen, I.M. Morton, J.E. Ørstavik, K.H. Sweeney, E. Wall, S.A. Marsh, J.L. Nürnberg, P. Passos- Bueno, M.R. Wilkie, A.O. (2007). American Journal of Human Genetics. 80(6): Kim, K. Oh, S.Y. Park, U.C. Wang, J.H. Lee, J.D. Kweon, H.J. Kim, S.Y. Park, S.H. Choi, D.K. Kim, C.G. Choi, S.H. (2007). Korean Journal of Gastroenterology. 49(4): Liu, Y. Wang, Q. Li, W. Huang, X. Zhen, M. Huang, S. Chen, L. Xue, L. Zhang, H. (2007). World Journal of Gastroenterology. 13(7): Marcos, I. Borrego, S. Antinolo, G. (2003). International Journal of Molecular Medicine. 12: McMahon, A.P. Ingham, P.W. Tabin, C.J. (2003). Current Topics in Developmental Biology. 53; Olkkonen, V.M. Stenmark, H. (1997). International Review of Cytology. 176: Oostra, R.J. Maas, M. (2006). American Journal of Medical Genetic A. 140(A19): Pepinsky, R.B. Zeng, C. Wen, D. Rayhorn, P. Baker, D.P. Williams, K.P. Bixler, S.A. Ambrose, C.M. Garber, E.A. Miatkowski, K. Taylor, F.R. Wang E.A. Galdes, A. (1998). Journal of Biological Chemistry. 273(22): Porter, J.A. Ekker, S.C. Park, W.J. von Kessler, D.P. Young, K.E. Chen, C.H. Ma, Y. Woods, A.S. Cotter, R.J. Koonin E.V. Beachy, P.A. (1996). Cell. 86(1): Riobo, N.A. Manning, D.R. (2007). Biochemistry Journal. 403(3): Ruiz, A. (1999). Trends in Genetics. 15(10): Ruizi, A. Sanchez, P. Dahmane, N. (2002). Nature Reviews Cancer. 2(5): Sali, A. Blundell, T.L. (1993). Journal of Molecular Biology. 234(3): Simpson, F. Kerr, M.C. Wicking, C. (2009). Mechanisms of Development. 126(5-6): van den Brink, G. Bleuming, S.A. Hardwick, J.C. Schepman, B.L. Offerhaus, G.J. Keller, J.J. Nielsen, C. Gaffield, W. van Deventer, S.J. Roberts, D.J. Peppelenbosch, M.P. (2004). Nature Genetics. 36(3): Wang, Y. Ng, E.L. Tang, B.L. (2006). Traffic. 7: Wang, Y. McMahon, A.P. Allen, B.L. (2007). Cell Biology. 19(2): Wang C, Liu Z, Huang X. (2012). PLoS ONE. 7(2): e Yang, L. Clinton, J.M. Blackburn,M.L. Zhang, Q. Zou, J. Zielinska-Kwiatkowska, A. Tang, B. Chansky, H.A. (2008). Journal of Biological Chemistry. 283(16): Yuan, Z. Goetz, J.A. Singh, S. Ogden, S.K. Petty, W.J. Black, C.C. Memoli, V.A. Dmitrovsky, E. Robbins, D.J. (2007). Oncogene. 26(7): Zhang, J. Lipinski, R. Shaw, A. Gipp, J. Bushman, W. (2007). Journal of Urology.177(3): Zhu, G. Zhang, L. Shehata, B. Wang, X. Cerwinka, W.H. Elmore, J. He, D. (2007). Prostate. 67(6):